新型低温电子显微镜技术有助于COVID-19疫苗的研制

突破性成像技术利用Camera Link HS接口处理数据需求。

编者注:本文发表于电子设计并已获许可在此发表。

影像技术的进步继续以不同的方式造福社会。例如，低温电子显微镜(cryo-EM)在COVID-19疫苗的开发中发挥了重要作用。结合了相机和探测器、样本处理技术、自动化和软件，低温电磁是一种易于使用的高质量数据收集方法。它最终帮助研究人员识别了导致COVID-19的SARS-CoV-2病毒的刺突蛋白。

一个漫长、自动化的过程

低温电子显微镜包括将样本快速冷冻到零下180°C，让蛋白质颗粒悬浮在冰中。样品组被放置在一个包含网格的支架中，网格通常由金或碳制成。网格内是带小孔或口袋的箔片。该系统将成像的材料在这些孔中包含的流体中快速冻结。

首先，研究人员使用Thermo Fisher Scientific公司的EPU 2软件来定义采集和光学设置，并验证高分辨率数据采集的适当显微镜对准。然后，软件获得网格概述，以确定网格是否具有足够的质量用于自动记录会话。网格被批量筛选，软件自动将网格方块分组到质量相似的类别中。

最后，选取网格方格和箔孔进行采集，并为每个箔孔定义采集模板。网格正方形和箔孔的选择可以通过应用用户定义的过滤器设置手动或自动完成。该系统使用电子束照亮单个孔洞，让相机捕捉图像。从那里开始，低温-电磁系统将电子束移动到孔中的多个位置或多个孔中，然后工作台移动，使电子束移动到下一个位置。光束有效地在每个样品孔的多个位置移动。由于该过程使用低电子剂量以避免损坏样品，并允许检测单个电子撞击，图像产生噪声和低对比度。该系统必须获取数千帧，这些帧被对齐和相加，以产生一个合适的图像。重建软件还可以去除噪声。

Thermo Fisher Scientific公司负责系统设计的工程师Hans Roeven说:“由于细节水平较低，系统操作员无法从图像中分辨出任何东西，所以只能看到噪音。”“该系统可以将1到2000个单独的帧组合在一起，生成具有足够对比度的图像，并将其输入到重建过程中。创建一个完整的3D重建需要成千上万的这样的图像，这就是为什么这个过程需要如此多的时间。提高相机速度(帧率)在减少整体数据收集时间方面发挥了重要作用，从而简化了工作流程，优化了客户的结果时间。”

低温电子显微镜和COVID-19

单粒子低温电子显微镜从获得的数千张图像中提取粒子，构建病毒或蛋白质的3D表征。这一过程产生了分离的SARS-CoV-2刺突蛋白的第一个3D结构。的峰值蛋白质是与其他细胞接触的关键点。在开始病毒复制之前，它与人类宿主细胞受体结合。据赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)亚太地区市场开发总监埃里克·陈(Eric Chen)说，禁用刺突蛋白的结合能力至关重要。在其鉴定之前，刺突蛋白是疫苗开发的一个重点。为了了解它的结构并生成结合位点的表位图，研究人员试图对其成像。Chen说，这将使他们能够确定哪些抗体或抑制剂会阻止病毒对接。

为了了解更多关于刺突蛋白的信息，加利福尼亚大学伯克利分校的一个研究小组最近使用了Thermo Fisher科学公司的Krios G4低温电磁仪器，该仪器配有一个工作在300千伏的冷场发射枪(CFEG)。用于图像捕获的是猎鹰4号探测器，它具有定制设计的4096 x 4096 CMOS图像传感器，内部帧率为250帧/秒。它被反向稀释到30 μ m，以确保电子撞击不会产生太大的电子云，这将在图像中出现一个大的块。利用FPGA通过Camera Link HS (CLHS)接口读取电子撞击和捕获的图像，并使用定制FPGA板组成的数据采集系统。

利用低温电子显微镜技术，加州大学伯克利分校的研究人员发现，这种刺突蛋白与其他已知的离子通道完全不同:它由半个通道组成，只穿透细胞膜的一半。SARS-CoV-2 ORF3a蛋白被认为是一种与自噬抑制、炎症小体激活和凋亡有关的病毒离子通道。据加州大学伯克利分校的研究小组称，在受感染的组织和血浆中发现了3a蛋白和抗3a抗体研究，发表于大自然。

研究人员发现，在动物模型中，SARS- cov -2中删除3a和在原始SARS病毒SARS- cov -1中删除相关3a基因可以降低疾病的严重程度。加州大学伯克利分校的研究人员指出，针对疫苗中的这种蛋白质，有助于降低人类COVID-19感染的严重程度。

CLHS应对数据挑战

虽然CLHS标准通常与机器视觉应用程序相关，但它提供的好处远远超出了工厂车间。赛默飞世尔在其透射电子显微镜(TEM)相机和探测器中利用了CLHS标准，包括用于识别刺突蛋白的系统。

瞬变电磁法的应用包括高分辨率、高速摄像机，可生成大量数据(图像)。Roeven表示，虽然赛默飞世尔科技公司使用摄像机和探测器已经有很长一段时间了，但减少总体数据收集时间是新产品开发的一个重要因素。

他说:“工作流自动化和图像采集速度是重要因素，新的相机开发涉及不断增长的数据速率，因此健壮、高速的接口是成功的关键。”“我们不仅想要标准化接口，还需要低延迟触发，以同步显微镜中的过程，CLHS提供的。”

在开发过程中，将资源输入FPGA存在一些挑战，因为该公司在单个FPGA中组合了多达8个通道。具体来说，接口需要适应为其他功能使用多个资源的设计。这需要仔细划分时钟资源，以添加一个8通道，10 Gbps接口。这使得系统能够有效地为CLHS X-Protocol IP核的多个实例共享资源- 64b/66b线编码，并为10 Gbps和更高的比特率设计了前向纠错。Roeven说:“除了关键的同步任务，CLHS提供的低延迟、零抖动链接触发器为我们在分区功能上提供了更多的自由，并允许系统以全部潜力运行。”

在系统中使用光纤电缆提供了电隔离，以避免系统接地故障，同时也提供了成本效益，因为具有QSFP+接口的fpga通常是现货供应的。此外，据Roeven说，光纤电缆有助于系统避免通过噪声造成的图像退化。

“使用光纤还允许我们将图像处理系统置于与仪器可接受的距离，这很重要，因为计算机服务器可能会产生大量噪音，而声波振动可能是图像退化的一个来源，当图像分辨率降到这样的水平时。”

未来的创新

虽然低温电子显微镜方法因在COVID-19疫苗开发中使用而获得了大量关注，但该技术已经流行了几年。它的创造者赢得了2017年诺贝尔化学奖"开发用于测定溶液中生物分子高分辨率结构的低温电子显微镜"这个过程被命名为2015年度工作方法通过大自然。

Cryo-EM系统也用于药物发现、植物生物学研究、病理学研究、癌症研究、材料科学和半导体检测。向前看，这项技术是值得关注的，因为它可能对生命科学和其他领域产生重大影响。